Les normes de la pharmacopée imposent l’absence de substances pyrogènes dans les produits pharmaceutiques qui entrent en contact avec la circulation sanguine ou le système nerveux central.

Ces substances pyrogènes, susceptibles de provoquer une augmentation de la température corporelle, sont notamment les endotoxines des bactéries gram (-), de nature lypopolysaccharidique (LPS), dont les effets généraux sont le mal de tête, la myalgie, les nausées, la leucopénie et une hypotension susceptible d’être létale (choc endotoxinique).
Ces bactéries sont fréquentes dans les circuits d’alimentation en eau. Une eau, même stérile, peut contenir ces endotoxines à l’état de traces car elles sont très difficiles à éliminer, étant résistantes à la chaleur et aux irradiations.

Le test du lysat d’amœbocytes de limule (LAL) est utilisé pour tester le produit final de médicaments injectables à usage humain (y compris les produits biologiques), de médicaments injectables à usage vétérinaire et de dispositifs médicaux. Le test LAL est recommandé dans l’industrie pharmaceutique pour la quantification des endotoxines dans les produits bruts utilisés dans la production, notamment l’eau, et pour la surveillance des taux d’endotoxines dans la fabrication.

Jaouida Ben Aouali

La recherche des pyrogènes est effectuée sur différents types de produits :
• En industrie pharmaceutique : matières premières, in-process, produits finis, matériel médico-chirurgical, produits sanguins.

• En centre hospitalier : clinique, centre de dialyse, eaux et produits de dialyse, poches de nutrition parentérale, solutions pour conservation d’organes.

Sachant que la limite acceptable pour l’homme est de 5 UE/kg/heure (UE : unité endotoxine), la méthode de référence de détection des endotoxines consiste, selon la pharmacopée américaine, en un test des pyrogènes ou test dit « du lapin », qui consiste à mesurer le taux d’augmentation de la température de trois lapins après injection intraveineuse de la solution à tester, l’élévation de la température devant être au maximum de Δ=1,15 °C.

L’hémolymphe de limule, cet arthropode marin ressemblant à un crabe ayant une forme de fer à cheval, d’où son nom, est de couleur bleue due à la présence d’hémocyanine au lieu d’hémoglobine. Ses cellules sont des amœbocytes qui réagissent en présence d’endotoxines bactériennes en produisant une protéine qui transforme l’hémolymphe en gel. La limule n’ayant pas de système immunitaire, ce gel lui permet de bloquer les infections bactériennes. Cette particularité fait que, depuis les années 1970, on utilise le sang de la limule pour produire un réactif, le lysat d’amœbocytes de limule (LAL), employé pour tester l’absence d’endotoxines. Le mélange LAL-échantillon est réalisé dans un tube à essai à 37 °C et la gélification se produit avant 1 heure d’incubation en cas de résultat positif, les sensibilités des lots de LAL allant de 0,03 à 0,5 UE.

Lorsque le test LAL est effectué conformément aux directives de la FDA, il peut remplacer le test de dépistage de pyrogènes de lapin de la pharmacopée américaine. La plupart des essais utilisant le LAL ont été réalisés avec des substances pharmaceutiques et médicales. Il est admis que ce test, bien que précis, demeure sensible aux interférences, dont les principales causes sont la température, les conditions de pH, l’absorption des endotoxines, la présence de certains cations, la modification de l’enzyme ou de la protéine coagulase, l’activation du LAL et les conséquences de la stérilisation.

Interférences de la température et du pH

La température d’incubation doit rester comprise entre 36 et 38 °C car la sensibilité du test est quasiment nulle à 25 °C. Le LAL est détruit à une température supérieure à 45 °C.
Les conditions optimales de pH pour l’utilisation du LAL sont comprises entre un pH égal à 6,4 et un pH égal à 8, la sensibilité du LAL étant altérée en dehors de cette fourchette. Certains contaminants présents au cours des échantillonnages réduisent ou augmentent le pH de l’échantillon. Il est donc recommandé de mesurer le pH d’un aliquot d’une solution de LAL en présence de l’échantillon à doser et, si besoin est, d’ajuster le pH par ajout de tampon acide ou basique. Il est toutefois recommandé de travailler, autant que possible, sur des solutions diluées, pour lesquelles les variations de pH sont moindres.

Certains extraits cellulosiques activent le réactif LAL, cependant les filtres en acétate de cellulose ne semblent pas activer la réaction. Dans tous les cas, il convient de vérifier que le filtre de prélèvement utilisé n’active pas la réaction en dosant systématiquement des « blancs » de filtres.

Interférences avec certaines protéines

Compte tenu des mécanismes de réaction, des interférences sont possibles avec certaines protéines. En effet, certaines études ont confirmé que la présence de protéases (enzymes à activité lytique sur les protéines) telles que la trypsine, la thrombine, la thromboplastine, etc., réagissent positivement avec le LAL en l’absence d’endotoxines.
Le biochimiste Friberger et collègues ont montré qu’une dilution au 1/10ème du plasma et une incubation à 70-80 °C pendant 5 minutes détruit les protéases.

Le LAL peut être activé par d’autres composants des bactéries gram(-) que les endotoxines, et même par ceux des moisissures. De nombreux composés tels que les exotoxines, le (1→3)-β-D-glucane, les peptidoglycanes, les lipides du plasma humain… donnent des résultats positifs au dosage en l’absence d’endotoxines. Dans tous les cas, ces substances sont réactives en présence de LAL, à des concentrations faibles, de l’ordre du µg/ml. Ces interférences, une fois identifiées, peuvent être éliminées par des techniques enzymatiques ou thermiques qui dénaturent ces protéines.

Cooper, en 1990, estime que 90 % des interférences peuvent être éliminées par simple dilution et chauffage des échantillons. Hollander et collègues, quant à eux et en 1993, suggèrent qu’un facteur de dilution optimum pour chaque échantillon ou chaque ambiance pourrait être déterminé pour les dosages réalisés par la méthode Klare.

Interférences modifiant les endotoxines

Les endotoxines sont susceptibles de réagir avec de nombreuses variétés de substances et ainsi de modifier leur conformation. Elles peuvent, en particulier, s’agglomérer pour former des molécules de poids moléculaire important. Ces modifications entraînent une diminution de la réactivité du LAL. La présence de cations monovalents et de certains anions polyvalents favorise la formation d’agrégats et réduit les concentrations d’endotoxines à des valeurs inférieures à 1 UE/ml.

Une source fréquente de contamination des échantillons réside dans le matériel de laboratoire utilisé. Pour la verrerie et les plastiques, en particulier, il est important de noter que les procédures habituelles de stérilisation n’éliminent pas toutes les substances contenant des endotoxines. Les matériaux exempts d’endotoxines à la fabrication résultent de processus à très haute température. La stérilisation à l’oxyde d’éthylène ne peut être utilisée car elle inhibe le LAL.

Le matériel de laboratoire optimal et les conditions de travail ont fait l’objet de nombreuses études. Les LPS ont tendance à adhérer aux parois des récipients en verre et en plastique mais peuvent être décrochés de ces parois par agitation.

Différents matériaux ont été testés. Des inhibiteurs ont été mis en évidence dans certains lots de tubes en polypropylène, celui-ci ayant par ailleurs une forte capacité d’absorption. Dans ce cas, l’utilisation de solution tampon à la place de l’eau augmente la récupération. Les études faites sur les tubes de polystyrène donnent de bons pourcentages de récupération des endotoxines, le pouvoir activateur de ce matériau restant négligeable. Ces matériels peuvent donc être utilisés sans risque d’absorption mais les meilleurs résultats sont obtenus pour le matériel en borosilicate.

En raison des possibilités de réutilisation et de stérilisation à des températures « apyrogénisantes », soit 4 heures à 180-190 °C, il est recommandé de préparer les solutions d’endotoxines dans du matériel en borosilicate, en s’assurant toutefois qu’il est dépourvu de toute trace de détergent. Les microplaques en polystyrène peuvent être utilisées en routine.

Rôle des cations

Les cations divalents Ca++ et Mg++ interviennent dans le mécanisme de réaction du LAL en transformant la proenzyme en enzyme active. La réaction du LAL peut être activée ou inhibée par des concentrations en Ca++, Mg++ et Na+ excessives. En réalité, plusieurs études ont permis de déterminer une fourchette de concentrations pour lesquelles la réaction se produit normalement mais, en dehors de cette fourchette, les cations peuvent être activateurs ou inhibiteurs.

Pour le calcium, la concentration optimale se situe entre 25 et 55 mM, des niveaux supérieurs à 250 mM étant inhibiteurs. Des études similaires ont été réalisées pour le sodium et le magnésium, ce dernier présentant une interaction bimodale : il est inhibiteur pour des concentrations de 25 à 50 mM, activateur à 25 mM et fortement activateur de 50 à 65 mM.

Il est souvent possible de limiter les interférences pour les cations en excès par dilutions successives. Pour ce qui est des cations déficients, des études ont été menées et permettent, selon les cas, de combler les manques : le calcium est ajouté sous forme de CaCl2 apyrogène.

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) couplée à la spectrométrie de masse

Actuellement, certains chimistes préfèrent doser les endotoxines dans l’air par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Les concentrations moyennes en endotoxines par ces techniques sont 30 à 50 fois plus élevées que par la méthode LAL. Cet essai a mis en évidence qu’un certain nombre de LPS collectés subsistent sur les filtres après extraction dans une solution tampon : 21 % sur des filtres d’acétate de cellulose et 26 % sur des filtres polycarbonate. 
D’autres démontrent, par ailleurs, que les résultats des dosages obtenus par LAL sont bien corrélés à la concentration déterminée en CPG en acides gras 3-hydroxylé si l’on ne prend en compte que les acides gras en C12 et C14. La corrélation est mauvaise si l’on considère l’ensemble des chaînes d’acides gras dosé par CPG-SM.

Conclusion

Les risques pour la santé liés à l’exposition aux bactéries et aux moisissures aéroportées, tant en milieu professionnel que dans l’habitat, sont connus. Cependant, bien que de nombreuses études se soient attachées à estimer le niveau d’exposition en endotoxines dans divers secteurs d’activité, la relation dose-effet n’a pas pu être établie.
De plus, les résultats des essais menés par des laboratoires différents, y compris dans les mêmes secteurs d’activité, sont mal corrélés. La diversité des techniques mises en œuvre selon les secteurs d’activité, à la fois pour les méthodes d’échantillonnage et d’analyse des endotoxines expliquent une grande part de cette dispersion des résultats.

Un certain nombre d’études récentes tentent d’imposer des conditions standards d’échantillonnage, de traitement des échantillons de conservation et de dosage.

Un rapport de 1 à 17 a pu être calculé entre deux procédure utilisant d’une part des filtres en ester de cellulose et de l’eau apyrogène pour l’extraction et d’autre part des filtres en fibre de verre et de l’eau apyrogène additionnée de 0,05 % de Tween 20, un surfactant polysorbique présentant un ester d’acide gras et une longue chaîne de polyoxyéthylène. L’utilisation de l’eau apyrogène, additionnée de 0,05 % de Tween 20, augmente les rendements d’extraction par rapport à l’utilisation de l’eau apyrogène sans modifier la cinétique de réaction des essais au test LAL. A l’inverse, un prélèvement réalisé sur ester de cellulose sous-estime le niveau d’endotoxines par rapport à un prélèvement réalisé sur filtres en fibre de verre. Par ailleurs, une succession de congélation et décongélation des échantillons réduit considérablement la concentration en endotoxines de ces échantillons.

Enfin, ces études démontrent également que les endotoxines extraites dans l’eau apyrogène additionnée de Tween ne se conservent qu’à des températures inférieures à -20 °C et ne supportent aucune recongélation.

Cette étude montre qu’à toutes les étapes d’échantillonnage et d’analyse des endotoxines dans l’air, différentes pratiques coexistent, même si la méthode de dosage par le LAL prédomine largement. L’élaboration de la norme devrait mettre un terme à toutes ces pratiques individuelles des laboratoires et imposer des conditions d’échantillonnage et de dosages stabilisées, permettant des essais comparatifs interlaboratoires. Ainsi, une meilleure estimation du niveau réel d’exposition aux endotoxines, dans tous les secteurs d’activité, devrait aider à établir une relation dose-effet sur la santé plus précise.